體外檢測淋巴細(xì)胞，首先需制備外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC），包括了淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，常用的方法是葡聚糖泛影葡胺（又稱淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法。用該法可去除紅細(xì)胞、粒細(xì)胞等成分，即為PBMC，分離純度可達(dá)95%。若需進一步純化其中的淋巴細(xì)胞，可將PBMC鋪于培養(yǎng)皿上，由于單核細(xì)胞易吸附玻璃，而留于平皿上，收集未吸附的細(xì)胞，即為富含淋巴細(xì)胞的懸液。若要分離T細(xì)胞，可用多種方法，如尼龍毛分離，抗CD3單克隆抗體，也有利用T細(xì)胞表面的CD2能結(jié)合綿羊紅細(xì)胞（SRBC），使其形成花結(jié)（E-花結(jié)試驗），比重增大，用密度梯度離心法將其與其他細(xì)胞分離。若要分離B細(xì)胞，可利用B細(xì)胞、單核細(xì)胞等能吸附尼龍毛的特性，將PBMC通過尼龍毛柱，B細(xì)胞吸附于柱上，T細(xì)胞被洗脫分離。如應(yīng)用以下方法，通過檢測淋巴細(xì)胞的某些表面標(biāo)志，又可鑒定出淋巴細(xì)胞的類型及比例。 （一） 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry） 是借助流式細(xì)胞儀（flow cytometer,FCM）對免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞進行快速準(zhǔn)確鑒定和分類的技術(shù)。流式細(xì)胞儀集光學(xué)、流體力學(xué)、電子學(xué)和計算機技術(shù)于一體，對細(xì)胞作多參數(shù)定量測定和綜合分析，包括細(xì)胞大小、核型、表面分子種類等。樣品經(jīng)多種熒光素標(biāo)記的抗體染色，因熒光素吸收與發(fā)射光譜的波長不同，信號能同時被吸收，因而能同時分析細(xì)胞表面多個分子的表達(dá)及表達(dá)程度?？蓹z測T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等及其比率，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，以及白血病、淋巴瘤的 免疫學(xué)分類。此外，可借光電效應(yīng)，微滴通過電場時出現(xiàn)不同偏向，因此可分類收集所需的細(xì)胞。該技術(shù)能以每秒約5 000個細(xì)胞的速度無菌收集細(xì)胞，一般一次分選純度在95%~98%，而且保持細(xì)胞活性，可進一步研究使用。 （二） 磁珠分離法 將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)于稱為微珠（平均直徑小于1.5μm）的磁性顆粒，與細(xì)胞懸液反應(yīng)后，微珠借抗體結(jié)合于相應(yīng)細(xì)胞群或亞群的表面。再將細(xì)胞懸液加于一柱內(nèi)，并置磁場中，因微珠被磁場吸收，將磁珠結(jié)合的細(xì)胞與磁珠非結(jié)合的細(xì)胞分開。如利用抗CD4交聯(lián)的微珠可將T細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞分開，從而獲得高純度的CD4+T細(xì)胞。 綜上所述，可以看出免疫學(xué)技術(shù)有很大的*性，可以直接從某些標(biāo)本中檢出微生物，也就是說應(yīng)用制備的各種狀態(tài)的抗體測定微生物性抗原，其敏感性可達(dá)幾十個微克的水平。分析微生物學(xué)及分子遺傳學(xué)檢測技術(shù)則試圖在傳統(tǒng)的形態(tài)、培養(yǎng)及生化學(xué)試驗的基礎(chǔ)上，尋求更快速、簡便而特異的新方法，但這些新方法大多仍不能脫離增菌培養(yǎng)的步驟，因為病原菌在病料標(biāo)本中的數(shù)量有限，要適應(yīng)各種分析方法的要求，在通常情況下，還必須進行培養(yǎng)，才能達(dá)到檢測分析的目的?？傊捎谛录夹g(shù)與電子計算機相結(jié)合，大大提高了反應(yīng)的準(zhǔn)確性、敏感性和快速性，常規(guī)檢驗的時間須以天來計算，而新的快速檢驗技術(shù)則縮短到以“時”計算，zui快的在一小時內(nèi)即可報告結(jié)果，其準(zhǔn)確性與常規(guī)法的相符率可達(dá)90%以上。 |
