白細(xì)胞介素2的制備及檢定 （一） 原理白細(xì)胞介素2（IL2）是Th細(xì)胞受有絲分裂原或特異性抗原刺激后，并在白細(xì)胞介素1的輔助下，產(chǎn)生的一種可溶性糖蛋白。IL2是體內(nèi)重要的廣譜免疫增強(qiáng)因子，臨床上常用于治療免疫缺陷病及腫瘤等。 （二） 材料和方法 1 制備粗制IL2無菌采血，肝素抗凝，用RPMI1640按1∶1將血液稀釋，然后重層于菲可液面上，以1 500r/min離心30min，取白細(xì)胞層，用RPMI1640洗2次，按1～3×106細(xì)胞/ml濃度加入10%胎牛血清RPMI1640，注入一裝有磁棒的大瓶中，置37℃攪拌培養(yǎng)4天，取出，分裝于50ml離心管中，1 500r/min離心20min，棄上清液，將細(xì)胞懸浮于1%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，使細(xì)胞濃度為106細(xì)胞/ml。同時(shí)加入純質(zhì)PHA1～2μg/ml以及多種B淋巴母細(xì)胞株，使其濃度為106細(xì)胞/ml，37℃攪拌培養(yǎng)18～24h后，取出以1 500r/min離心30min，取上清，用045μg濾膜過濾除菌，濾液即為粗制IL2。 2 制備精品IL2 （1） 硫酸銨沉淀與真空濃縮透析：在4℃下將硫酸銨粉末按50%飽和量加入上述粗制IL2中，攪拌2h，12 000g離心30min，取上清液，再加入80%飽和硫酸銨，4℃過夜，次日以12 000g離心30min，棄上清液，將沉淀溶于01% PEG 6 000的1∶2 PBS溶液（pH值73）中，置真空負(fù)壓濃縮透析器中透析濃縮至所需容量。 （2） Sephadex G100凝膠過濾：用2×180cm的過濾柱及PBS（同上），以80ml/h流速過濾。將各管洗脫液用紫外分光光度計(jì)280nm檢測(cè)其OD值。同時(shí)將幾種不同分子量的標(biāo)準(zhǔn) 蛋白也用相同條件過濾及檢測(cè)其OD值，繪出IL2及標(biāo)準(zhǔn)蛋白OD值的曲線。將各管洗脫液過濾除菌后，作白細(xì)胞生物活性試驗(yàn)，按試驗(yàn)結(jié)果繪出曲線，找出具有zui高IL2活性的幾管洗脫液，混合后，作下一步精制。 （3） BlueSepharose層析：將上述混合后的洗脫液加入BlueSepharose柱中，流速約15ml/h，按每管10ml收集流出液，當(dāng)樣品全部流出柱中以后，用上述PBS洗滌樣品柱，再用梯度NaCl溶液（從0075mol/L至06mol/L NaCl的PBS溶液）洗脫，按2ml/管收集洗脫液。NaCl 溶液梯度及流速均由梯度混合器調(diào)節(jié)控制。洗脫完畢后，作各管OD值及NaCl濃度的測(cè)定。各管洗脫液過濾除菌后，作出生物活性測(cè)定。將峰值前后的數(shù)管洗脫液混合，即為精制的IL2。置－20℃冰箱保存。 （三） 檢定 1 活性測(cè)定用10%胎牛血清RPMI1640將上述IL2稀釋為50%、25%、125%、625%，而后再將每個(gè)百分濃度以及100%濃度的IL2倍比稀釋，自1∶2至1∶128，將每個(gè)稀釋度分別加入多孔板的孔中，每孔01ml。然后取CT6細(xì)胞株（小鼠的IL2依賴性T細(xì)胞株），調(diào)整濃度為106細(xì)胞/ml，每孔加入01ml，同時(shí)用培養(yǎng)基代替IL2作對(duì)照。將多孔板培養(yǎng)24h后，取出按每孔1μci的濃度加H3標(biāo)記胸腺嘧啶核苷繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出后用MESHⅡ細(xì)胞收集器過濾洗滌細(xì)胞，用β計(jì)數(shù)器測(cè)定各孔細(xì)胞的cpm。必要時(shí)按此結(jié)果繪出曲線，確定活性單位。 2 蛋白含量測(cè)定采用分光光度計(jì)，分別測(cè)得OD280及OD260，然后按下式計(jì)算：蛋白含量（mg/ml）=（144×OD280-075×OD260）×稀釋倍數(shù) 3 毒性試驗(yàn)及細(xì)菌檢查參考胸腺肽制備部分。 |
