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酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒[ELISA Kit]
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豬傳染性胃腸炎病毒抗體-IgG (TGEV-IgG)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書
點擊次數(shù):1043 更新時間:2010-07-07

 

本試劑盒僅供研究使用
 
特異性:本試劑盒用于檢測豬TGEV特異性抗體 (IgG),且與其他相關(guān)抗體無交叉反應(yīng)。
有效期:6個月
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法測定豬血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中TGEV (IgG)。
說明
l        試劑盒保存:-20(較長時間不用時);2-8℃(頻繁使用時)。
l        濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
l        中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準(zhǔn)。
l        剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
實驗原理
TGEV抗原包被酶標(biāo)板,制成固相載體。向微孔中先加入待測樣品進行反應(yīng),然后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG進行反應(yīng),經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TGEV (IgG)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品中抗體的效價(抗血清zui終能顯色的zui高稀釋倍數(shù)記為效價)。
試劑盒組成及試劑配制
1.         酶聯(lián)板(Assay plate )                                          一塊(96孔)。
2.         樣品稀釋液(Sample Diluent                                    1×20ml/瓶。
3.         辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG稀釋液(HRP-anti-porcine IgG Diluent1×10ml/瓶。
4.         辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgGHRP-anti-porcine IgG   1×120μl/瓶(1100)。
5.         底物溶液(TMB Substrate                                     1×10ml/瓶。
6.         濃洗滌液(Wash Buffer           1×20ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
7.         終止液(Stop Solution                             1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
需要而未提供的試劑和器材
1.        標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.        高速離心機
3.        電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.        干凈的試管和Eppendof
5.        系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,一次檢測樣品較多時,用多通道移液器
6.    蒸餾水,容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存
1.        血清:全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或室溫過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.        血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或將標(biāo)本放于-20-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.        細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。
標(biāo)本的稀釋原則:
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量,確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過程中,應(yīng)做好詳細的記錄。zui后計算抗體效價時,稀釋了“N”倍,標(biāo)本中抗體的效價為“N”。
辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG的稀釋原則:
臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG稀釋液稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100μl),實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。
操作步驟
實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?,試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.        加樣:分別設(shè)空白孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl,余孔加待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。
2.        棄去液體,甩干,洗3次,每次浸泡1-2分鐘,200μl/每孔。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG工作液 100μl(取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,每次使用前配制),37℃,60分鐘。
3.        棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,200μl/每孔,甩干。
4.        依序每孔加底物溶液90μl37℃避光顯色30分鐘內(nèi),此時肉眼可見孔內(nèi)有明顯藍色,即可終止)。
5.        依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
6.        用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
實驗備注
l        用戶在初次使用試劑盒時,應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,以便試劑集中到管底。
l      每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
l        為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
l        未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,請于2-8℃保存。辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG工作液。
l        建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
為檢測樣品中TGEV (IgG)效價,客戶可以采取樣品2倍倍比稀釋樣品計算抗體效價,一般采取以1:40為起始稀釋倍數(shù)(使用樣品稀釋液進行稀釋)。zui大稀釋倍數(shù)根據(jù)客戶自身試驗要求而定,zui終顯色與陰性對照孔進行比較,有明顯差異的zui大稀釋度定為抗體的zui終效價。
注意事項
l       本操作說明適用于48T試劑盒,但48T試劑盒所有試劑減半。
l        當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩,避免起泡。
l        洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。
l        一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
l        如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
l        在配制檢測溶液工作液時,請以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。
l        底物請避光保存。
l        不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
 
 
   
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