本試劑盒僅供研究使用 特異性：本試劑盒用于檢測豬TGEV特異性抗體 （IgG），且與其他相關(guān)抗體無交叉反應(yīng)。 有效期：6個月 預(yù)期應(yīng)用：ELISA法測定豬血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中TGEV （IgG）。 說明 l 試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。 l 濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 l 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。 l 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。 實驗原理 用TGEV抗原包被酶標(biāo)板，制成固相載體。向微孔中先加入待測樣品進行反應(yīng)，然后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG進行反應(yīng)，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TGEV （IgG）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品中抗體的效價（抗血清zui終能顯色的zui高稀釋倍數(shù)記為效價）。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）： 一塊（96孔）。 2. 樣品稀釋液（Sample Diluent）： 1×20ml/瓶。 3. 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG稀釋液（HRP-anti-porcine IgG Diluent）：1×10ml/瓶。 4. 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG（HRP-anti-porcine IgG）： 1×120μl/瓶（1：100）。 5. 底物溶液（TMB Substrate）： 1×10ml/瓶。 6. 濃洗滌液（Wash Buffer）： 1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 7. 終止液（Stop Solution）： 1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 需要而未提供的試劑和器材 1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀 2. 高速離心機 3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱 4. 干凈的試管和Eppendof管 5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器 6. 蒸餾水，容量瓶等 標(biāo)本的采集及保存 1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或室溫過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。 標(biāo)本的稀釋原則： 首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細的記錄。zui后計算抗體效價時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本中抗體的效價為“N”。 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG的稀釋原則： 臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。 操作步驟 實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。 1. 加樣：分別設(shè)空白孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔加待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)60分鐘。 2. 棄去液體，甩干，洗3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，每次使用前配制），37℃，60分鐘。 3. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。 4. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見孔內(nèi)有明顯藍色，即可終止）。 5. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。 6. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。 實驗備注 l 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。 l 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 l 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。 l 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗豬IgG工作液。 l 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。 洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。 計算 為檢測樣品中TGEV （IgG）效價，客戶可以采取樣品2倍倍比稀釋樣品計算抗體效價，一般采取以1:40為起始稀釋倍數(shù)（使用樣品稀釋液進行稀釋）。zui大稀釋倍數(shù)根據(jù)客戶自身試驗要求而定，zui終顯色與陰性對照孔進行比較，有明顯差異的zui大稀釋度定為抗體的zui終效價。 注意事項 l 本操作說明適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。 l 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。 l 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。 l 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 l 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。 l 在配制檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。 l 底物請避光保存。 l 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。 |
