本試劑盒僅供研究使用
檢測范圍：0.312pmol/ml - 20 pmol/ml
zui低檢測限：0.078 pmol/ml
特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人DPD，且與其他相關蛋白無
交叉反應。
有效期：6 個月
預期應用：ELISA 法定量測定人血清、血漿或其它相關生物液體中DPD
含量。
說明
1. 試劑盒保存：未開封的試劑盒應儲存于2-8℃；開封后的酶標板應與干燥
劑一起儲存于鋁箔袋中置于2-8℃保存。僅在此出儲存條件下，產(chǎn)品在有
效期內可正常使用。
2. 濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象，不會對實
驗結果造成任何影響。
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實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗DPD 抗體的微孔中
依次加入標本或標準品、生物素化的抗DPD 抗體、HRP 標記的親和素，經(jīng)
過*洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，
并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的DPD 呈正相關。
用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）： 一塊（96孔）。
2. 標準品（Standard）： 2 瓶（凍干品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）： 1×20ml/瓶。
4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）： 1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent） 1×10ml/瓶。
6. 生物素標記抗體（Biotin-antibody）： 1×120μl/瓶（1：100）。
7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）： 1×120μl/瓶（1：100）。
8. 底物溶液（TMB Substrate）： 1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer） 1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。
10. 終止液（Stop Solution）： 1×10ml/瓶。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規(guī)格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof 管
5. 系列可調節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
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標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4℃過夜后于1000g 離心20 分鐘，
取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于-20℃或-80℃保存，但
應避免反復凍融。解凍后的樣品應再次離心，然后檢測。
2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后30 分鐘內于2 - 8°C
1000 g 離心15 分鐘，取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于
-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。解凍后的樣品應再次離心，然后
檢測。
3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g 離心20 分鐘，取上清即可立即
檢測；或進行分裝，并將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
解凍后的樣品應再次離心，然后檢測。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。
只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應
做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。
標準品的稀釋原則：2 瓶，使用前于6000-10000rpm 離心30 秒。每
瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，然后反復顛倒
/搓動以助溶解，其濃度為20 pmol/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋20
pmol/ml, 10pmol/ml, 5 pmol/ml, 2.5 pmol/ml, 1.25 pmol/ml, 0.625 pmol/ml,
0.312 pmol/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pmol/ml，臨用前15 分鐘內
配制，用完丟棄，下次檢測使用新鮮配置的標準品。
如配制10 pmol/ml 標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）20pmol/ml 的上述標
準品加入含0.5ml 樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此
類推。
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生物素標記抗體的稀釋原則：
打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀
釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際
配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物素標記抗體加990μl 生物素標記抗體
稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：
打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以辣根過氧化物酶標記親和
素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔
100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl 辣根過氧化物酶標記親和素
加990μl 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用
前一小時內配制。
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻
時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品
稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。加樣時，槍頭應直接對
準液面，切勿沿孔壁加樣。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，
余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于
酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，
37℃反應120 分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
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2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl
生物素標記抗體加99μl 生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，
在使用前一小時內配制），37℃,60 分鐘。
3. 溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，
200μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液）
100μl，37℃，60 分鐘。
5. 溫育60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，
200μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30 分鐘內，此時肉眼可見標
準品的前3-4 孔有明顯的梯度藍色，后3-4 孔顯色不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加
入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底
物反應時間到后應盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。在加終止液
后15 分鐘以內進行檢測。
實驗備注
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到
管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶
液及終止液。測量時先用此孔調OD 值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上
蓋或覆膜。
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4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體
工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請
勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液、或辣根過氧化物
酶標記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上
鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml
注入孔內，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
請從我們的下載專業(yè)軟件"Curve Exert 1.3"，并根據(jù)提示制作標準曲線。
以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD 值為縱坐標（普通坐標），在半對
數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；
再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方
程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即
為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 本操作說明適用于48T試劑盒， 48T試劑盒中酶聯(lián)板、標準品、生物素
標記抗體及辣根過氧化物酶標記親和素減半。
2. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
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3. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
4. 一次加樣時間控制在5 分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
5. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
6. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋
倍數(shù)。
7. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
8. 底物請避光保存。
9. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。 |
