3 競爭抑制ELISA方法的建立
3.1 抗體的酶標記及質量鑒定
本試驗采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶標記在抗體上[1]，標記完后取上清用Sephedex G200 凝膠層析進行純化，洗脫液為0.2mol/L pH7.4的PBS，流速為15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度計測A280吸光度值，以洗脫體積為橫坐標，吸光值為縱坐標做圖，收集*峰即為酶標抗體峰。
標記完后用紫外分光光度計在分別在280nm、及403nm處測定酶標記物的A值，計算免疫球蛋白量、摩爾比值、酶結合率以及標記率。
3.2 包被用緩沖液及zui適包被抗原濃度的優(yōu)化
3.2.1 包被緩沖液的優(yōu)化
包被抗原時，為了得到*的包被效果，我們采用了碳酸鹽緩沖液（50mM ph9.6 ）、磷酸鹽緩沖液（50mM ph7.6）、以及TRIS鹽酸緩沖液（50 mM ph7.6）三種緩沖液作為包被液，抗原包被濃度為5ug/ml，及2.5ug/ml,酶標抗體工作濃度為1：400及1：300，用自動酶標儀分析，選擇*的包被緩沖液系統(tǒng)（表5）。同時為了保證緩沖液能夠長期保存，我們在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作為防腐劑。
3.2.2 zui適抗原包被濃度的優(yōu)化
用優(yōu)化好的包被緩沖液，將包被抗原（ALB）稀釋成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六個濃度，包被微孔板，每孔100ul；競爭抗原濃度為4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶標抗體稀釋度為1：300，經孵育、顯色、終止后用自動酶標儀分析（表6）。顯色的強度在一定范圍內與包被的抗原量成正比，但隨著包被抗原濃度的增加，顯色的強度反而降低，我們選擇臨界包被值作為包被抗原量。
3.3 封閉液、洗滌液及保護液的優(yōu)化
3.3.1 封閉液的優(yōu)化
采用文獻報道的方法進行封閉，其封閉液的組成為：10mM磷酸鹽緩沖液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。
3.3.2 洗滌液的配制
采用文獻報道的方法配制洗滌液。
3.3.2 酶標板保護液的優(yōu)化
酶標板經過封閉后在低溫下僅能存放2周左右，為了延長固相酶標板上抗原的穩(wěn)定性，我們增加了一步保護酶標板的程序。在10mM的磷酸鹽中加入適量的糖、無關蛋白質、慶大霉素以及二價金屬離子，作為酶標板保護劑，在封閉完后加入保護液于4℃冰箱中孵育過夜，同時與未做保護的酶標板進行對照，然后將保護的及未保護的酶標板置于37烘箱中放置15天，考察保護液對酶標板的穩(wěn)定性的影響。
3.4 酶標抗體稀釋度的優(yōu)化
抗原包被濃度為4ug/ml,將酶標抗體做系列稀釋：1：100，1：200；1：300；1：400；1：500；1：600；1：1000；經孵育、洗滌后、顯色終止后，用自動酶標儀分析（表7），選擇A值為1.5左右的酶標抗體稀釋度為zui適工作濃度。
3.5 酶標抗體保護液的優(yōu)化
低濃度的酶標抗體極容易受到高溫、微生物、以及蛋白酶的影響而失活，嚴重影響產品的貨架期，過去通常將酶標抗體凍干保存，然而這樣的保存，不僅由于在凍干的過程中會影響酶標抗體的活性，而且在臨床應用中頗為不便。適當的緩沖液以及添加無關蛋白質、糖、防腐劑以及一些含氨基的化合物等都會對對酶標抗體的活性起一定的保護作用，因此我們設計了一組保護劑用于保護酶標抗體，與未添加任何糖蛋白的酶標抗體做對照，將經保護的酶標抗體及未保護的酶標抗體置于37℃烘箱中放置6天，考察保護液對酶標抗體的影響。
3.6 底物液的優(yōu)化
常用的作為酶聯(lián)免疫吸附試劑有OPD和TMB系統(tǒng)，由于OPD有致癌的危險性以及用前需要溶解等諸多缺點，因此我們選用TMB作為底物系統(tǒng)，采用文獻報道的方法：取適量的TMB溶解在DMSO中，然后加入適量的超純水，配制作為底物B液；溶解適量的過氧化氫尿素于100mM磷酸-檸檬酸緩沖液中，配制作為底物A液，用前將底物A液及底物B液等體積混合。
在文獻報道的基礎上，我們適當調整了TMB的用量以及過氧化氫尿素的用量，并加入了酶促進劑，與文獻報道的底物進行比較。實驗方案為：將活化的辣根過氧化物酶分別作1：1000；1：10000；1：100000；1：200000；1：400000；1：800000等系列稀釋，比較兩種不同配方的底物的靈敏度（表10）。
3.7 標準品及樣品稀釋液
我們采用10mM的磷酸鹽緩沖液內含0.5%的BSA作為標準品及樣品的稀釋液。
3.8 抗原抗體反應時間的優(yōu)化
抗原抗體反應會隨著時間的增加，反應量也增加，但達到一定的時間后，反應即達到平衡，我們取反應10min，20min，30min，40min，50min，60min，
70min,90min等8個點進行比較（表11），以確定*抗原抗體反應時間。
3.9 底物作用時間的優(yōu)化
在其它條件相同的情況下，我們取5min,10min,15min,20min,25min,30min,35min
40min,50min,60min,80min等11個時間點進行比較（表12），確定*的底物作用時間。
3.10 劑量反應曲線的建立及曲線擬合方式的確定
在其他參數均已經優(yōu)化完成的情況下，將抗原標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：160mg/L,80mg/L，40mg/L，20mg/L，10mg/L，5mg/L，2.5mg/L，1.25mg/L，0.625mg/L，
0.3125 mg/L，0.156 mg/L，0.780 mg/L等12個稀釋度，同時設置陰性和空白對照，加入已包被好抗原的酶標板中，同時加入酶標抗體，經孵育、顯色、終止后用自動酶標儀分析（表12），采用文獻報道的4P對數擬合曲線 |
