由于ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學反應的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。而另一方面又由于酶標記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應，產(chǎn)生放大作用，正因為此種放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一種既敏感又特異的方法。, U8 [ y$ z8 g# K（ `4 U2 Y
ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：6 U/ R（ B8 w. _3 D） s" {. X
（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；
（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；; G# N. `（ I H5 L* L$ a
（3）酶反應的底物。$ j8 ^3 @. X. p6 Y8 n1 m
根據(jù)試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：& T6 ?- D6 i; Q0 r" W
雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法，屬于非競爭結(jié)合測定。它是檢測抗原zui常用的ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測。" K! q% {/ _6 W; M$ P6 y, ~
其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復合物。由于反應系統(tǒng)中固相抗體和酶標抗體的量相對于待測抗原是過量的,因此復合物的形成量與待測抗原的含量成正比（在方法可檢測范圍內(nèi)）。測定復合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量（OD值），即可確定待測抗原含量。
若固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個不同的抗原決定簇結(jié)合，則屬于雙位點夾心法。
若采用固相載體上的抗原和酶標抗原分別與樣品中被檢測抗體分子結(jié)合，則是雙抗原夾心法。, _* A3 l, {$ l* x" j4 p
操作步驟：
（1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
（2）加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
（3）加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān)。
（4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標本中抗原的量。（ R8 ~# I） M S" E
在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。
現(xiàn)多采用針對單一抗原決定簇特異性的單克隆抗體做固相化和酶標抗體，則受檢樣品和酶標抗體可一次性加入，簡化流程，縮短反應時間。若標本中待測抗原濃度過高，抗原可分別與酶標抗體和固相抗體結(jié)合而不形成上述夾心復合物（類似于免疫沉淀反應中抗原過剩時的后帶現(xiàn)象），使zui終結(jié)果低于實際含量（鉤狀效應），甚至出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。因此對此類標本應適當稀釋后再測定。另外，當血清中存在類風濕因子（RF）時，類風濕因子（RF）可充當抗原，而形成固相抗體-類風濕因子-酶標抗體夾心復合物，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結(jié)果將低于實際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應。采用F（ab）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標。$ ]2 I0 W5 J! W7 B
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雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
` 雙抗原夾心法用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物，此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBsAg的檢測常采用雙抗原夾心法。雙抗原夾心法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標記方法。* E） @） |
