所用的方法稱為間接法,也是目前zui常用的方法,其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。 此法是測(cè)定抗體zui常用的方法,屬非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。其原理是將抗原連接到固相載體上,樣品中待測(cè)抗體與之結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復(fù)合物,再用酶標(biāo)二抗(針對(duì)受檢抗體的抗體,如羊抗人IgG抗體)與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合,形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物,測(cè)定加底物后的顯色程度,確定待測(cè)抗體含量。 間接法首先用抗原包被于固相載體,這些包被的抗原必須是可溶性的,或者至少是極微小的顆粒,經(jīng)洗滌,加入含有被測(cè)抗體之標(biāo)本,再經(jīng)孵育洗滌后,加入酶標(biāo)記抗抗體,(對(duì)人的標(biāo)本來(lái)說(shuō)即加酶標(biāo)抗人球蛋白IgG、IgM),再經(jīng)孵育洗滌后,加底物顯色,底物降解的量,即為欲測(cè)抗體的量,其結(jié)果可用目測(cè)或用分光光度計(jì)定量測(cè)定,本法用不同種抗原包被固相載體后,只要用一種酶標(biāo)記抗人球蛋白,即可作多種人的傳染病、寄生蟲(chóng)病以及其他疾病的血清學(xué)診斷。如用酶標(biāo)記抗人IgM,則可用于早期診斷。 操作步驟: ?。?)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。# @* F# f6 Y1 s& K) i# P (2)加稀釋的受檢血清,保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。 ?。?)加酶標(biāo)抗抗體??捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體,但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合,從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。- @7 m+ J C2 j1 L; W" r ?。?)加底物顯色 間接法由于采用的酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類免疫球蛋白分子(如抗人IgG),因此該法只需要換固相抗原,即可用一種酶標(biāo)二抗檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體,具有更廣泛的通用性。( ]# L6 ~0 K& z- \\6 a% M 本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。 間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果,但應(yīng)盡可能予以純化,以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì),例如以E.Coli為工程酶的重組抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能與受過(guò)E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)??乖幸膊荒芎信c酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì),例如來(lái)自人血漿或人體組織的抗原,如不將其中的Ig去除,試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)。另外如抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白,也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?br /> 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng),非特異IgG可直接吸附到固相載體上,有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中,抗原包被后一般用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封閉(blocking)固相上的空余間隙。另外,在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋(1:40~1:200),以避免過(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。 |