所用的方法稱為間接法，也是目前zui常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。
此法是測(cè)定抗體zui常用的方法,屬非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)。其原理是將抗原連接到固相載體上，樣品中待測(cè)抗體與之結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗（針對(duì)受檢抗體的抗體，如羊抗人IgG抗體）與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，測(cè)定加底物后的顯色程度，確定待測(cè)抗體含量。
間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測(cè)抗體之標(biāo)本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標(biāo)記抗抗體，（對(duì)人的標(biāo)本來(lái)說(shuō)即加酶標(biāo)抗人球蛋白IgG、IgM），再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色,底物降解的量，即為欲測(cè)抗體的量，其結(jié)果可用目測(cè)或用分光光度計(jì)定量測(cè)定，本法用不同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標(biāo)記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲(chóng)病以及其他疾病的血清學(xué)診斷。如用酶標(biāo)記抗人IgM,則可用于早期診斷。
操作步驟：
?。?）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。# @* F# f6 Y1 s& K） i# P
（2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。
?。?）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。- @7 m+ J C2 j1 L; W" r
?。?）加底物顯色
間接法由于采用的酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類免疫球蛋白分子（如抗人IgG）,因此該法只需要換固相抗原，即可用一種酶標(biāo)二抗檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體，具有更廣泛的通用性。（ ]# L6 ~0 K& z- \\6 a% M
本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。
間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過(guò)E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)?？乖幸膊荒芎信c酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來(lái)自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)。另外如抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白，也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?br /> 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。 |
