預期應用 本酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒運用雙抗體夾心ELISA 法定量測定小鼠組織勻漿或其它相 關生物液體中GCK 含量。 本試劑盒已提供的試劑 試劑名稱 數(shù)量 96 孔板（預包被） 1 標準品（凍干） 2 標準品稀釋液 1 × 20ml 檢測溶液A 1 × 120μl 檢測溶液B 1 × 120μl 檢測稀釋液A （2 x） 1 × 6ml 檢測稀釋液B （2 x） 1 × 6ml TMB 底物 1 × 9ml 終止液 1 × 6ml 濃洗滌液（30 x） 1 × 20ml 96 孔板覆膜 4 使用說明書 1 本試劑盒未提供但需自備的設備及試劑 1、450±10nm 濾光片的酶標儀（建議儀器使用前提前預熱） 2、單道和多道微量加液器及吸頭 3、稀釋樣品的EP 管 4、蒸餾水或去離子水 5、吸水紙 6、盛放洗液的容器 試劑盒的儲存及有效期 所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將標準品、檢 測溶液A、檢測溶液B 以及96 孔板保存于-20℃ 。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存 于-20℃ ，避免潮濕。有效期為6 個月。 實驗原理 將GCK 抗體包被于96 孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中依次加入標準品和標本， 其中的GCK 與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，洗板之后加入生物素化的GCK 抗體，將 未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP 標記的親和素，再次*洗滌后加入底物（TMB） 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏 色的深淺和樣品中的GCK 呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（ O.D值），計 算樣品濃度。 標本的采集與保存 1、組織勻漿：將動物的組織標本先用PBS 洗滌，去除多余血液，勻漿化后放在5-10 ml PBS 中于-20℃放置過夜，第二天，經(jīng)過二次反復凍融破膜，將勻漿物5000xg 離心5 分鐘，取上清即可檢測。 2、其它生物標本：請1000Xg 離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃ 或- 80℃ 保存，但應避免反復凍融。 注意： 1、以上標本均需密封保存，4℃ 保存應小于1 周，-20℃不應超過1 個月，-80℃不應超 過2 個月。 2、標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。 試劑準備 1、使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫（18-25℃ ），試劑不能直接在37℃ 溶解。 2、標準品（凍干品）：每瓶標準品用標準品稀釋液稀釋至1mL，蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為100 U/L。準備7 個稀釋標準品的EP 管，每個EP 管中加入500μl 的標準品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，1.56 U/L，標準品稀釋液（0 U/L）直 接作為空白孔。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。 3、檢測稀釋液A 及檢測稀釋液B：用6mL 蒸餾水或去離子水將6mL 濃檢測液A 及B 稀 釋至12mL，進行2 倍稀釋，稀釋后的工作液不宜進行冷凍保存。 4、檢測溶液A 及檢測溶液B：Detection A 及Detection B 在使用前請手甩幾下或少時 離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液A 或B 1:100 稀釋（如：10μl 檢測溶液A / 990μl 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預 先計算好的每次實驗所需的總量配制（100μl /孔），實際配制時應多配制0.1-0.2mL。 5、濃洗滌液：用580mL 蒸餾水或去離子水將20mL 濃洗滌液稀釋至600mL，進行30 倍稀釋。 6、底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的TMB 至另一干凈容器中使用，容器 中剩余的底物應予丟棄，不要倒回TMB 瓶中。 注意： 1、標準品請于臨用前15 分鐘內(nèi)配制。該標準品只能使用一次。 2、標準品的稀釋不能直接在板中進行。 3、標準品、檢測溶液A 工作液、檢測溶液B 工作液請使用相應的稀釋液配制，不能混 淆?；靹驎r要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實驗結(jié)果的準確請使用微量吸管，并 校準微量加液器。請依據(jù)所需的量配制，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A 時，一次不要小于10μl ），以避免造成濃度誤差。 4、請勿重復使用已經(jīng)稀釋過的標準品、檢測溶液A 工作液和檢測溶液B 工作液。 5、濃洗滌液中如有結(jié)晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結(jié)晶*溶解再進行配 制。 操作步驟 實驗前應預測標本含量，如果標本濃度過高，應對標本進行稀釋，使稀釋后的標本符 合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù)。 1、加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7 孔，依次加入100μl 不同 濃度的標準品（見試劑準備2）?？瞻卓准?00μl（見試劑準備第二步zui后一管），余 孔加待測樣品100μl ，酶標板加上覆膜，37℃ 溫育2 小時。 2、棄去液體，甩干，不用洗滌。 3、每孔加檢測溶液A 工作液100μl （臨用前配制），酶標板加上覆膜，37℃ 溫育1 小時。 4、棄去孔內(nèi)液體，每孔用400μl 的洗滌液洗滌，浸泡1-2 分鐘，甩干（也可輕拍將孔內(nèi) 液體拍干），重復洗板3 次。zui后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液*甩干。 5、每孔加檢測溶液B 工作液（臨用前配制）100μl ，加上覆膜，37℃ 溫育30 分鐘。 6、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟4。 7、每孔加底物溶液90μl ，酶標板加上覆膜，37℃ 避光顯色（反應時間控制在15-25 分鐘， 不要超過30 分鐘。當標準孔的前3-4 孔有明顯的梯度藍色，后3-4 孔梯度不明顯時， 即可終止）。 8、每孔加終止溶液50μl ，終止反應，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應盡量與底 物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。 9、在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在450nm 波長測量各孔的光 密度（O.D 值）。 注意： 1、試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說 明書要求保存，以備下次使用。 2、加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將 樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，*個孔 與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從 而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間（包括標準品及所有 樣品）控制在10 分鐘內(nèi)。推薦設置復孔進行實驗。 3、溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體 蒸發(fā)，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)，同時應 嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。 4、洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程 中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要 消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。 5、反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10 分鐘觀 察一次），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀 光密度讀數(shù)。 6、底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。 計算 各標準品及樣本O.D值扣除空白孔O.D值后作圖（七點圖），如設置復孔，則應取 其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標），O.D值為橫坐標（對數(shù)坐標），在 對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線（*方程式應依回歸方程計算的R2 值來定，以R2 值越趨近O.D 于1 為好）。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3，根據(jù)樣品 值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與O.D值計算出標準 曲線的回歸方程式，將樣品的O.D值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即 為樣品的實際濃度。 檢測范圍：1.56 U/L - 100 U/L zui低檢測限：1 U/L 此值為20 個空白樣品（即標準品稀釋液）測定的平均值加三倍標準差所對應的濃度。 特異性 本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠GCK，且與其它相關蛋白無明顯交叉反應。 說明 1、由于現(xiàn)有條件及科學技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定 與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風險。 2、zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關， 請務必準備充足的標本備份。 3、本試劑盒不能排除標本中可能含有的可溶性受體，配體，結(jié)合蛋白和其它相關因子對 實驗所產(chǎn)生的干擾。 4、只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，因為所有試劑都是有關聯(lián)的，不 能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到*的檢測結(jié)果。 5、在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微 生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。 6、剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任 何影響。請勿提前將酶標板從包裝袋里拿出。 7、本試劑盒有效期：六個月。 8、請使用配備有450±10nm 濾光片的酶標儀，且該酶標儀測量范圍在0.001-3.000 O.D， 或以上。 9、本操作說明同樣適用于48T 試劑盒，但48T 試劑盒所有試劑減半。 警告 本試劑盒中使用硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應避免接觸衣物或眼、 手等皮膚暴露部位。 |
