預(yù)期應(yīng)用 本酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒運(yùn)用雙抗體夾心ELISA 法定量測(cè)定小鼠組織勻漿或其它相 關(guān)生物液體中GCK 含量。 本試劑盒已提供的試劑 試劑名稱 數(shù)量 96 孔板（預(yù)包被） 1 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干） 2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1 × 20ml 檢測(cè)溶液A 1 × 120μl 檢測(cè)溶液B 1 × 120μl 檢測(cè)稀釋液A （2 x） 1 × 6ml 檢測(cè)稀釋液B （2 x） 1 × 6ml TMB 底物 1 × 9ml 終止液 1 × 6ml 濃洗滌液（30 x） 1 × 20ml 96 孔板覆膜 4 使用說(shuō)明書(shū) 1 本試劑盒未提供但需自備的設(shè)備及試劑 1、450±10nm 濾光片的酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱） 2、單道和多道微量加液器及吸頭 3、稀釋樣品的EP 管 4、蒸餾水或去離子水 5、吸水紙 6、盛放洗液的容器 試劑盒的儲(chǔ)存及有效期 所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請(qǐng)注意，收到試劑盒后請(qǐng)盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢 測(cè)溶液A、檢測(cè)溶液B 以及96 孔板保存于-20℃ 。開(kāi)封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存 于-20℃ ，避免潮濕。有效期為6 個(gè)月。 實(shí)驗(yàn)原理 將GCK 抗體包被于96 孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本， 其中的GCK 與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，洗板之后加入生物素化的GCK 抗體，將 未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入HRP 標(biāo)記的親和素，再次*洗滌后加入底物（TMB） 顯色。TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏 色的深淺和樣品中的GCK 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ O.D值），計(jì) 算樣品濃度。 標(biāo)本的采集與保存 1、組織勻漿：將動(dòng)物的組織標(biāo)本先用PBS 洗滌，去除多余血液，勻漿化后放在5-10 ml PBS 中于-20℃放置過(guò)夜，第二天，經(jīng)過(guò)二次反復(fù)凍融破膜，將勻漿物5000xg 離心5 分鐘，取上清即可檢測(cè)。 2、其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000Xg 離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃ 或- 80℃ 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 注意： 1、以上標(biāo)本均需密封保存，4℃ 保存應(yīng)小于1 周，-20℃不應(yīng)超過(guò)1 個(gè)月，-80℃不應(yīng)超 過(guò)2 個(gè)月。 2、標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。 試劑準(zhǔn)備 1、使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫（18-25℃ ），試劑不能直接在37℃ 溶解。 2、標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋至1mL，蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為100 U/L。準(zhǔn)備7 個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP 管，每個(gè)EP 管中加入500μl 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，1.56 U/L，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（0 U/L）直 接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 3、檢測(cè)稀釋液A 及檢測(cè)稀釋液B：用6mL 蒸餾水或去離子水將6mL 濃檢測(cè)液A 及B 稀 釋至12mL，進(jìn)行2 倍稀釋，稀釋后的工作液不宜進(jìn)行冷凍保存。 4、檢測(cè)溶液A 及檢測(cè)溶液B：Detection A 及Detection B 在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí) 離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測(cè)稀釋液A 或B 1:100 稀釋（如：10μl 檢測(cè)溶液A / 990μl 檢測(cè)稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù) 先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100μl /孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2mL。 5、濃洗滌液：用580mL 蒸餾水或去離子水將20mL 濃洗滌液稀釋至600mL，進(jìn)行30 倍稀釋。 6、底物溶液：請(qǐng)用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的TMB 至另一干凈容器中使用，容器 中剩余的底物應(yīng)予丟棄，不要倒回TMB 瓶中。 注意： 1、標(biāo)準(zhǔn)品請(qǐng)于臨用前15 分鐘內(nèi)配制。該標(biāo)準(zhǔn)品只能使用一次。 2、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋不能直接在板中進(jìn)行。 3、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A 工作液、檢測(cè)溶液B 工作液請(qǐng)使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混 淆?；靹驎r(shí)要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確請(qǐng)使用微量吸管，并 校準(zhǔn)微量加液器。請(qǐng)依據(jù)所需的量配制，盡量不要微量配制（如吸取檢測(cè)溶液A 時(shí)，一次不要小于10μl ），以避免造成濃度誤差。 4、請(qǐng)勿重復(fù)使用已經(jīng)稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A 工作液和檢測(cè)溶液B 工作液。 5、濃洗滌液中如有結(jié)晶析出，請(qǐng)先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結(jié)晶*溶解再進(jìn)行配 制。 操作步驟 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)標(biāo)本含量，如果標(biāo)本濃度過(guò)高，應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋，使稀釋后的標(biāo)本符 合試劑盒的檢測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。 1、加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7 孔，依次加入100μl 不同 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（見(jiàn)試劑準(zhǔn)備2）?？瞻卓准?00μl（見(jiàn)試劑準(zhǔn)備第二步zui后一管），余 孔加待測(cè)樣品100μl ，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃ 溫育2 小時(shí)。 2、棄去液體，甩干，不用洗滌。 3、每孔加檢測(cè)溶液A 工作液100μl （臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37℃ 溫育1 小時(shí)。 4、棄去孔內(nèi)液體，每孔用400μl 的洗滌液洗滌，浸泡1-2 分鐘，甩干（也可輕拍將孔內(nèi) 液體拍干），重復(fù)洗板3 次。zui后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液*甩干。 5、每孔加檢測(cè)溶液B 工作液（臨用前配制）100μl ，加上覆膜，37℃ 溫育30 分鐘。 6、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟4。 7、每孔加底物溶液90μl ，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃ 避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在15-25 分鐘， 不要超過(guò)30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4 孔梯度不明顯時(shí)， 即可終止）。 8、每孔加終止溶液50μl ，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底 物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請(qǐng)輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。 9、在確保酶標(biāo)板底無(wú)水滴及孔內(nèi)無(wú)氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光 密度（O.D 值）。 注意： 1、試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說(shuō) 明書(shū)要求保存，以備下次使用。 2、加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡，將 樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。加樣或加試劑時(shí)，*個(gè)孔 與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從 而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此，一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有 樣品）控制在10 分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3、溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體 蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應(yīng) 嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。 4、洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過(guò)程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過(guò)程 中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要 消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。 5、反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10 分鐘觀 察一次），如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀 光密度讀數(shù)。 6、底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。 計(jì)算 各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本O.D值扣除空白孔O.D值后作圖（七點(diǎn)圖），如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取 其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），O.D值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在 對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（*方程式應(yīng)依回歸方程計(jì)算的R2 值來(lái)定，以R2 值越趨近O.D 于1 為好）。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3，根據(jù)樣品 值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與O.D值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn) 曲線的回歸方程式，將樣品的O.D值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即 為樣品的實(shí)際濃度。 檢測(cè)范圍：1.56 U/L - 100 U/L zui低檢測(cè)限：1 U/L 此值為20 個(gè)空白樣品（即標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）測(cè)定的平均值加三倍標(biāo)準(zhǔn)差所對(duì)應(yīng)的濃度。 特異性 本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的小鼠GCK，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)明顯交叉反應(yīng)。 說(shuō)明 1、由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對(duì)所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定 與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。 2、zui終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)， 請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。 3、本試劑盒不能排除標(biāo)本中可能含有的可溶性受體，配體，結(jié)合蛋白和其它相關(guān)因子對(duì) 實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的干擾。 4、只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測(cè)效果，因?yàn)樗性噭┒际怯嘘P(guān)聯(lián)的，不 能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到*的檢測(cè)結(jié)果。 5、在儲(chǔ)存及溫育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微 生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。 6、剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任 何影響。請(qǐng)勿提前將酶標(biāo)板從包裝袋里拿出。 7、本試劑盒有效期：六個(gè)月。 8、請(qǐng)使用配備有450±10nm 濾光片的酶標(biāo)儀，且該酶標(biāo)儀測(cè)量范圍在0.001-3.000 O.D， 或以上。 9、本操作說(shuō)明同樣適用于48T 試劑盒，但48T 試劑盒所有試劑減半。 警告 本試劑盒中使用硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)避免接觸衣物或眼、 手等皮膚暴露部位。 |
