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一、實(shí)驗?zāi)康?br />1.深入了解ELISA 法測定抗體效價的原理。
2.掌握ELISA 法測定單克隆抗體效價的方法。
二、實(shí)驗原理
ELISA 是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。免疫酶技術(shù)是將酶標(biāo)記在抗體/抗原分子上，形成酶標(biāo)抗體/酶標(biāo)抗原，稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體。ELISA 法是免疫酶技術(shù)的一種，其特點(diǎn)是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板（或球）吸附抗原/抗體，使之固相化，免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)都在其中進(jìn)行。在每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌，這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系，也避免了末反應(yīng)的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA 法中．酶促反應(yīng)只進(jìn)行一次，而抗原、抗體的免疫反應(yīng)可進(jìn)行一次或數(shù)次，即可用二抗（抗抗體）、三抗再次進(jìn)行免疫反應(yīng)。
目前常用的幾種ELISA 方法有：測定抗體的間接法，測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等。本實(shí)驗采用間接法測定單克隆抗體效價。其主要過程為：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應(yīng)板的凹孔內(nèi)，加待測抗體，保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，加酶標(biāo)抗抗體，保溫后洗滌，加底物保溫30分鐘后，加酸或堿終止酶促反應(yīng)，用目測或光電比色測定抗體含量。
三、儀器、原料和試劑
儀器
聚苯乙烯96孔酶標(biāo)板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。
原料
單克隆抗體
試劑
1. 抗原及酶標(biāo)記抗體
①抗原：兔抗人IgG（Rabbit Aanti-human IgG，Code No．A0423）；
②酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP（Rabbit Anti-mouse IgG-HRP，Code No．P0260）；均為
DAKO 公司產(chǎn)品，使用時按照說明書要求稀釋。

4. 洗滌液（含0.05％Tween 20的PBS）：1LPBS 中加入Tween-20 500μL。
5. 封閉液（含1％牛血清白蛋白，0.1％Tween 20的PBS）：10mLPBS 中加入100mgBSA，10μLTween-20。
6. 底物溶液
①磷酸鈉鹽緩沖液（0.1mol/LpH6.0）：稱Na₂HPO₄·12H₂O2.2g，NaH₂PO₄·2H₂O 6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL。
② TMB 貯液：稱60mgTMB 溶于10mL 二甲基亞砜中，4℃避光保存。
③底物應(yīng)用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，磷酸鈉緩沖液10mL，TNB 貯液10μL。30％H₂O₂ 15μL，混勻。
7. 終止液：2mol/LH₂SO₄
四、操作步驟
①抗原包被：兔抗人IgG 作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板
中。4℃放置過夜。
②洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次。
③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h。
④洗滌：用洗滌液洗3次。
⑤加待測樣品（一抗）：將含單克降抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清在另—塊板上用PBS 連續(xù)稀釋（按照1：2或1：10），100μL /孔加到已包被的板上，每個樣品平行做兩份，PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h。
⑥洗滌：用洗滌液洗3次。
⑦加酶標(biāo)抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l ：8000稀釋，100μL／孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。
⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。
⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍(lán)色。
⑩終止反應(yīng)、比色：加50μL/孔終止液．顏色變黃；用酶標(biāo)儀測定450nm 處各孔的吸光值，陽性反應(yīng)的zui大稀釋度為待測樣品的效價。