ELISA 實驗的結(jié)果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認真負責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA 的高靈敏，強特異的優(yōu)點。因此,應(yīng)建立實驗項目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。 ◎加樣應(yīng)用微量移液器（加樣槍）按規(guī)定的量加入微孔板的1/3 處避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 ◎每次加樣應(yīng)更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發(fā)生交叉污染;干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。 ◎樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應(yīng)，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30 秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。 ◎如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去*滴有氣泡的試劑后加樣。 ◎抗原抗體反應(yīng)需要在一定溫度下（37°C），經(jīng)過一定的時間才能達到反應(yīng)的平衡點 ◎ELISA 邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達到平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3 處，不可將板條疊加放置。 ◎邊緣效應(yīng)（2ng/mlHBsAg 一步法三種不同溫育法的結(jié)果） ◎ELISA 是靠洗滌來達到分離結(jié)合與未結(jié)合抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)記物的目的，同時洗滌也可將非特異吸附的蛋白質(zhì)的干擾以及血球、細菌中的酶干擾清除掉。 ◎手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內(nèi)反應(yīng)液； 2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）； 3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3 分鐘，間歇搖動； 4）甩去孔內(nèi)液體，拍板，用紙吸干。 重復(fù)以上操作至少5 次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。 ◎洗板機洗板一定要預(yù)先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內(nèi)液體全部吸干，同時要設(shè)置一定的浸泡時間。如出現(xiàn)機洗后拍板有較多殘留液時應(yīng)再用手工洗2 次以上。關(guān)機前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。 ◎HRP 催化底物的一步呈色反應(yīng)，同樣需要一定的時間和溫度， ◎一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度（一般為37°C，10-15 分鐘）恒定反應(yīng)后終止 ◎或根據(jù)臨界值質(zhì)控血清吸光度值達0.2 左右使的時間而恒定反應(yīng)時間. ◎顯色反應(yīng)終止后應(yīng)立刻比色（30 分鐘內(nèi)）。 常見的顯色系統(tǒng)有OPD 和TMB 二種，以后者zui為常見，而TMB 酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。OPD 終止后顯棕色，測定波長為490nm； TMB 終止后顯黃色，測定波長為450nm，二種底物的校正波長均用6 30nm。使用雙波長的優(yōu)點可以消除反應(yīng)板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反應(yīng)板應(yīng)用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色，否則吸光度易出現(xiàn)負值或損壞濾光片。 ◎定性試驗國內(nèi)外為便于統(tǒng)一計算，一律按S/C.O 方式報告，S 為標(biāo)本A 值，C.O 即Cut Off 值（陽性判定值） ◎夾心法和間接法以S/C.O≥1 為陽性； 竟?fàn)幏ㄅc中和法以S/C.O﹤1 為陽性 ◎Cut Off 的計算公式以試劑盒說明書的為準(zhǔn)常見的有： ◎A） C.O=2.1×N（當(dāng)N 不足0.05 時按0.05 計）， ◎此公式由P/N>2.1 換算而來，常用于夾心法。 ◎B） C.O=0.5×N，從抑止率公式換算而來， ◎常用于竟?fàn)?，中和?/span> ◎C） C.O=N+C（C 為常數(shù)），用于間接法。 ◎D） C.O=C×P+N（C 為常數(shù)），用于間接法。此公式zui客觀，但對生產(chǎn)廠家要求很高，陰陽性對照測定值要基本恒定。 定量分析用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋，ELISA 測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以量或單位表示。 ELISA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測標(biāo)本做在同一塊板上。 現(xiàn)有的ELISA 定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線，要得到的結(jié)果實屬不易。因此嚴禁用定性試劑盒做定量分析。 把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO 值上下的一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復(fù)實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則報告+（陽性）。 灰區(qū)概念對血站系統(tǒng)的獻血員篩查尤為重要。 灰區(qū)的設(shè)置有二種： 1）C.O×（1±CV）， CV 為該試劑的批內(nèi)CV& nbsp; （一般在15-20%間）； 2）C.O±2s，s 為實驗室做室內(nèi)質(zhì)控ROC 的s 。 ◎在二位點夾心ELISA 中，其劑量反應(yīng)曲線的高劑量（HIGH DOSE，HD）區(qū)段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀（HOOK），MILES（197 4）根據(jù)此現(xiàn)象寫實性地稱之為"HD-HOOK" 效應(yīng)。產(chǎn)生該現(xiàn)象的分子機理有"分子變構(gòu)說"和"濃度效應(yīng)"等推論。 ◎一步法和二步法均存在，只是前者出現(xiàn)的更早些，大多數(shù)是高值低吸光度，很少陰性結(jié)果。 |
