分析前質(zhì)控 人員培訓(xùn)實驗是人操作的，因此檢驗人員需經(jīng)過培訓(xùn)，熟練掌握本專業(yè)如下幾方面的技術(shù)知識： ◎檢驗項目的基本原理（ELISA 原理）； ◎臨床意義； ◎熟悉檢測技巧，了解易出差錯的環(huán)節(jié)及難點； ◎熟悉檢測試劑性能（包括試劑盒組成，包被片段及其組成）； ◎熟悉檢測儀器的原理及性能；掌握數(shù)據(jù)處理的能力和質(zhì)量控制知識。 ◎某些特殊項目的檢測如抗HIV 等需經(jīng)有關(guān)部門組織的專門培訓(xùn)班，考試合格后持證上崗。 ◎ELISA 原理：1971 年Engvall 等人把免疫組化的EIA 技術(shù)應(yīng)用于臨床檢驗發(fā)展為ELISA 技術(shù)。 特點：在固相表面組裝免疫活性物質(zhì)形成"免疫吸附劑" 酶標記免疫活性物質(zhì)，進行信號放大； 有二步溫育反應(yīng)二次洗滌過程； 靈敏度特異性相對較高。 局限性：只能檢測到ng 水平 精密度差（批內(nèi)CV15-20%）； 線性范圍窄（一個數(shù)量級）； 存在"HD-HOOK" 效應(yīng)。 以乙肝檢測為例，衛(wèi)生部規(guī)定乙肝試劑，丙肝試劑，艾滋病試劑，梅毒試劑及血型試劑必須使用經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標簽的產(chǎn)品，試劑應(yīng)從靈敏度，特異性，精密度，穩(wěn)定性，簡便性，安全性及經(jīng)濟性作出全面的評價。 ◎靈敏度：有二層含義，1）為試劑檢出被檢物質(zhì)的zui低量的能力；2）為試劑對人群或大量樣品中陽性檢出的能力（假陰性越少越好），取決于包被物的全面性。 ◎特異性：指試劑正確檢定不存在的被檢物質(zhì)的能力（無假陽性），取決于包被抗原（體）及標記抗原（體）的純度及特異性。 ◎精密度：ELISA 試劑一般指其批內(nèi)CV，其值應(yīng)小于15%；定量試劑應(yīng)同時考察線性范圍 ◎穩(wěn)定性：試劑在規(guī)定條件下能儲存的時間，一般采用破壞性試驗即將試劑存放于37℃保存，定期測定其靈敏度，特異性和精密度等指標，直到其質(zhì)量指標開始下降為止，通常認為37℃每穩(wěn)定一天相當于4-10 ℃保存一個半月。 ◎簡便性：指在不影響試劑的前三項指標的前題下，實驗和測定步驟越少越好，在定性試驗中結(jié)果判斷簡單明了，）定量試驗結(jié)果計算也應(yīng)簡單。 ◎安全性：指試劑對操作者和環(huán)境安全無害無傳染性。 ◎經(jīng)濟性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生產(chǎn)或技術(shù)進步降低成本而市場價格比較合理。 為使儀器保持*工作狀態(tài)應(yīng)建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍），水浴箱（溫箱），洗板機和酶標儀。 ◎移液器：ELISA 加樣量?。?/span>5-100ｕl），其準確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應(yīng)在±10%以內(nèi)； ◎水浴箱經(jīng)常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差； ◎洗板機每個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定一般不超過2ul ，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞； ◎酶標儀經(jīng)常維護其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。 ◎濾光片波長精度檢查：將不同波長的濾光片從酶標儀上卸下，用UV-2201 型紫外-可見分光光度計（波長精度±0.3nm）于可見光區(qū)對每個濾光片進行掃描，其檢測值與標定值之差為濾光片波長精度。 ◎通噵差與孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標板小孔杯（杯底須光滑，透明，無污染以酶標板架作載體，將其（內(nèi)含200ul 甲基橙溶液吸光度調(diào)至0.500A左右）置于8 個通道的相應(yīng)位置，蒸溜水調(diào)零，1 于490nm 處連續(xù)測三次 ,觀察其不同通道的檢測器測量結(jié)果的一致性，可用極差值來表示?？组g差的測量是選擇同一廠家，同一批號酶標2 板條（8 條共96 孔）分別加入200ul 甲基橙溶液（吸光度調(diào)至0.100A左右）先后置于同一通道，蒸溜水調(diào)零,于490nm 處檢測，其誤差大小用±1.96s 衡量。 n 零點飄移（穩(wěn)定性觀察）：取8 只小孔杯分別置于8 個通道的相應(yīng)位置，均加入200ul 蒸溜水并調(diào)零，于490nm 處每隔30 分鐘測一次，觀察各個通道4 小時內(nèi)吸光度的變化。 ◎精密度評價：每個通道3 只小杯分別加入200ul 高中低3 種不同．濃度的甲基橙溶解，蒸溜水調(diào)零，于490nm 作雙份平行測定，每日測二次（上下午各一次），連續(xù)測定20 天。分別計算其批內(nèi)精密度，日內(nèi)批精密度,日間精密度和總精密度及相應(yīng)的CV 值。 ◎線性測定：用電子天平稱取甲基橙配制5 個系列的溶液，于490nm 平行測8 次，取其均值。計算其回歸方程，相關(guān)系數(shù)及標準估計誤差s，并用±1.96s 表示樣品測量的誤差范圍.雙波長測定評價：取一分甲基橙溶液，分別加入3 種不同濃度的溶血液（測定波長為490nm，校正波長為585nm），先后于8 個通道檢測，每個通道測3 次，51 比較各組之間是否具有統(tǒng)計學(xué)差異，以考察雙波長消除干擾組分的效果。 ◎一般酶標儀無585nm 濾光片，可選用550nm 或630nm 濾光片。450nm 濾光片的檢定選用普魯蘭溶液（校正波長為630nm） ◎試劑評價需要有的血清考核盤（ Panel）進行檢測，一般實驗室不易從生檢所或臨檢中心取得，每進一次試劑評價一次也很麻煩?？梢酝ㄟ^間接的信息對試劑進行選擇。 ◎根據(jù)該試劑生檢所批批檢定報告，了解其質(zhì)量水平，按照質(zhì)量計劃選擇靈敏度高的或特異性高的試劑； ◎通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源（基因工程或合成多肽），片段的組合（按比例混合或化學(xué)合成），片段的長短等判斷試劑的優(yōu)劣； ◎參考室間質(zhì)評評價報告中對試劑的評價結(jié)果，這比較客觀公正，因為統(tǒng)計數(shù)字均來自各參評醫(yī)院，反映了試劑在某一地區(qū)的使用情況； ◎根據(jù)部門發(fā)布的試劑評價結(jié)果，了解市場上試劑的質(zhì)量優(yōu)劣。 ◎可用作 ELISA 的標本十分廣泛，體液（如血清，血漿，各種積液），分泌物（如唾液）和排瀉物（如糞便，尿液）均可作為標本以測定其中的抗原或抗體成分，一般使用血清。 n 標本采集時應(yīng)盡量避免溶血，因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀方法的結(jié)果，可造成假陽性；長菌的標本同樣的道理易產(chǎn)生假陽性。 ◎抗凝不*的標本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑。 ◎標本在冰箱中保存時間過長易導(dǎo)致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4℃冰箱5 天內(nèi)完成測試。如需保存一周以上則要-20℃冰凍保存，融解時應(yīng)上下顛倒充分混勻，同時避免氣泡。 ◎ELISA 的靈敏度>1ng/ml 水平上,標本間的污染要盡量避免，尤其不應(yīng)與生化試驗用同一管標本.zui起碼應(yīng)先做免疫后做生化。 |
