半抗原是指本身無免疫原性，只具有反應(yīng)原性的物質(zhì)。半抗原物質(zhì)多數(shù)為低分子量的化學(xué)，例如多糖、多肽、甾體激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核酸、某些藥物（包括抗生素）以及其他化學(xué)物品等。半抗原不能直接用作免疫原，只有把這些半抗原和大分子物質(zhì)結(jié)合后，才具有免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞。這種經(jīng)過人工修飾的半抗原稱之為人工抗原，用于偶聯(lián)半抗原的大分子物質(zhì)稱為載體。 一、常用的載體 1、蛋白質(zhì)類 蛋白質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的膠體兩性化合物，是一種常用的良好載體。其中以白蛋白zui為普遍，這是由于白蛋白具有較高的溶解度，免疫原性強(qiáng)，取材方便。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白等，以牛血清白蛋白zui為常用。 2、多肽聚合物 多肽聚合物是人工合成的。常見的有多聚賴氨酸，分子量可達(dá)十幾萬到幾十萬，是良好的載體。這種多聚物和半抗原結(jié)合后，可刺激動(dòng)物產(chǎn)生高滴度、高親和力的抗體。多聚賴氨酸可與半抗原的-NH2或-COOH結(jié)合。 3、大分子聚合物 包括羧甲基纖維素、聚乙烯比咯烷酮等。大分子聚合物皆可與半抗原結(jié)合，加入弗氏佐劑可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生價(jià)的抗體。 二、選擇載體時(shí)應(yīng)考慮以下因素 1、帶有正電荷的堿性蛋白往往是好的免疫源 2、大分子聚合物必須經(jīng)體內(nèi)酶解后才能誘發(fā)反應(yīng)，不能被分解者如堿性消旋蛋白，阿拉伯膠、D-氨基酸聚合物等不能用做載體 3、當(dāng)半抗原接在載體上引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變時(shí)，才能誘發(fā)半抗原抗體。小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間以"橋"（space bridge）的形式連接。Marks認(rèn)為，4個(gè)碳（C）的"橋"是zui合適的C鏈 4、載體免疫源性的強(qiáng)弱與產(chǎn)生半抗原抗體的水平有關(guān)，但并不是的 5、半抗原與載體蛋白的分子比很重要，一般認(rèn)為兩者的比為10～20∶1 三、半抗原與載體連接時(shí)，應(yīng)選擇合適的方法，結(jié)合方式的選擇應(yīng)考慮如下因素 1、半抗原的溶解度和穩(wěn)定性 在結(jié)合反應(yīng)中應(yīng)不導(dǎo)致半抗原活性的改變，同時(shí)也不能使載體變性至不溶解的程度。 2、結(jié)合鍵的位置 抗體對(duì)遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)聯(lián)接點(diǎn)的半抗原部分有的特異性，故聯(lián)接時(shí)應(yīng)使聯(lián)接鍵遠(yuǎn)離半抗原的決定簇。 3、選擇適合的偶聯(lián)試劑 不同的半抗原在偶聯(lián)時(shí)，應(yīng)根據(jù)半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以及反應(yīng)方式選擇適當(dāng)?shù)呐悸?lián)試劑。如小分子肽類有一定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，在溶液中依靠氨基酸殘基來維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。因此，用雙功能的亞氨酸酯不但對(duì)氨基酸有選擇，而且能代替被取代的每一個(gè)ε-氨基的正電荷。蛋白質(zhì)與偶聯(lián)劑接觸后，使不同蛋白質(zhì)分子的功能基團(tuán)交聯(lián)并凝聚。廣泛交聯(lián)的蛋白質(zhì)，其溶解度常降低，而這種溶解度差的蛋白質(zhì)卻是有效的免疫源。 四、連接方法 半抗原與載體的連接通?？捎梦锢砗突瘜W(xué)方法進(jìn)行。物理吸附的載體有羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，它們借電荷和微孔吸附半抗原?；瘜W(xué)法則是利用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到載體上，這些載體包括血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、銅藍(lán)蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚賴氨酸。帶有游離氨基或游離羧基以及兩種基團(tuán)都有的半抗原，可直接與載體連接。其他不帶有氨基或羧基的半抗原，須加以適當(dāng)?shù)母脑?，使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹в杏坞x氨基或游離羧基的衍生物，才能與載體連接。 1、有游離氨基或游離羧基以及兩種基團(tuán)都有的半抗原與載體的連接方法 （1）碳化二亞胺法 碳化二亞胺是一種化學(xué)性質(zhì)非?；钴S的雙功能試劑，它們既可與半抗原上的羧基又可與半抗原上的氨基縮合。 此法非常簡便，只要將半抗原與載體蛋白質(zhì)按一定分子比混合在適當(dāng)?shù)娜芤褐校缓蠹尤胩级啺?，攪拌l～2h，置室溫反應(yīng)24h，zui后透析除去未反應(yīng)的半抗原，即可得到人工免疫原。 （2）戊二醛法 戍二醛是帶有兩個(gè)活性基團(tuán)雙功能的連結(jié)劑，它借助兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價(jià)鍵連接。 （3）混和酸酐法 混合酸酐法又稱為氯甲基異丁酯法，主要用以甾體激素與蛋白質(zhì)的偶連。以烷基氯甲基為偶連劑，zui常用的是氯甲基異丁酯。含有羧基的半抗原與氯甲基異丁酯反應(yīng)形成混合酸酐，然后在與蛋白質(zhì)載體上的氨基反應(yīng)形成肽鍵。 （4）過碘酸氧化法 過碘酸將糖環(huán)氧化成雙醛基，再與蛋白質(zhì)上的氨基偶聯(lián)。本法常用于配糖體類藥物與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。 2、帶有氨基或羧基的半抗原可用下面方法改造后，再用上述方法進(jìn)行連接 （1）琥珀酸酐法 本法用于帶有羥基的半抗原的改造。琥珀酸酐加水轉(zhuǎn)變成琥珀酸。如將帶有羥基的半抗原和琥珀酸酐在無水吡啶中反應(yīng)，即可得到帶有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。 （2）羧甲基羥胺法 帶有酮基的半抗原（如孕酮、睪酮）與O-（羧甲基）羥胺反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌铩?/p> （3）重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法 本法適于帶有酚基的半抗原（如某些藥物）的改造。先將對(duì)氨基苯甲酸和亞硝酸鈉反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物再作用于帶有酚基的半抗原，從而制得帶有羧基的半抗原衍生物。 （4）一氯醋酸鈉 本法適于帶有酚基半抗原的改造。將帶有酚基的藥物與一氯醋酸鈉反應(yīng)即可得到帶有羧基的半抗原衍生物。 五、人工免疫原的鑒定 1、抗體的特異性 為獲得特異性強(qiáng)的抗體，并不是半抗原分子上任何功能基團(tuán)都可以用來與蛋白質(zhì)聯(lián)接，也不是毫無選擇的在半抗原分子上添加可以與載體聯(lián)接的功能基團(tuán)。根據(jù)目前的認(rèn)識(shí)，抗體的特異性主要是針對(duì)距蛋白質(zhì)聯(lián)接點(diǎn)zui遠(yuǎn)端的半抗原部分。因此，應(yīng)將對(duì)免疫識(shí)別來說zui不重要的半抗原部分聯(lián)接到蛋白質(zhì)上。這就是所謂的聯(lián)接半抗原的"遠(yuǎn)距離"原則。如雌二醇的特殊功能基團(tuán)有兩個(gè)，即C3-OH和C17-OH。如在C6位與蛋白質(zhì)聯(lián)接，形成E2-6-（O-羧甲基）肟，則所得到的抗血清的特異性就好；如在C17位與蛋白質(zhì)聯(lián)接，形成E2-17-半琥珀酸酯，則所得到的抗血清的特異性就差。前者與雌素酮和雌三醇的交叉廣反應(yīng)率分別為8.0%和0.3%，而后者分別為100%和10%。在實(shí)際聯(lián)接時(shí)可用特殊試劑將特異的功能基團(tuán)封閉，然后進(jìn)行偶聯(lián)，zui后再將封閉劑去掉。 2、半抗原的取代水平 半抗原聯(lián)接到載體蛋白上的分子數(shù)可影響動(dòng)物產(chǎn)生抗體的能力。結(jié)合半抗原的多少，依半抗原的性質(zhì)和動(dòng)物的品種而異。文獻(xiàn)報(bào)告每個(gè)載體分子只含一個(gè)半抗原分子就足以產(chǎn)生半抗原的抗體。一般認(rèn)為，如以白蛋白為載體，每個(gè)白蛋白分子上聯(lián)接5～30個(gè)半抗原分子較好。從有利于激發(fā)對(duì)半抗原親和力強(qiáng)的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，聯(lián)接到蛋白質(zhì)上的半抗原數(shù)少一些可能更好。但也有人認(rèn)為，在免疫后期某些細(xì)胞逐漸對(duì)半抗原顯示足夠高的親和力，以致能用半抗原-異源載體（即與初始免疫時(shí)所用的載體不同）結(jié)合物進(jìn)行觸發(fā)，此時(shí)免疫應(yīng)答的大小可能部分的與半抗原的取代數(shù)目有關(guān)。 半抗原的取代水平可用放射性示蹤法或分光光度法進(jìn)行測定。 六、放射性示蹤法 在偶聯(lián)的反應(yīng)液中加入一定量的放射性標(biāo)記半抗原。偶聯(lián)反應(yīng)后經(jīng)充分透析，測量透析袋中的放射性計(jì)數(shù)，并計(jì)算結(jié)合到載體上的放射性百分?jǐn)?shù)。這個(gè)百分?jǐn)?shù)指示有同樣百分比的非標(biāo)記半抗原聯(lián)接到載體上。結(jié)合抗原中半抗原與蛋白質(zhì)的分子比可用下列公式計(jì)算： [Pm1 / MW1 ] / [m2 / MW2 ] 其中：P = 放射性百分?jǐn)?shù)；m1 = 半抗原投入量；MW1 = 半抗原的分子量； m2 = 蛋白質(zhì)的投入量； MW2 = 蛋白質(zhì)的分子量。 七、分光光度法 根據(jù)半抗原的克分子消光系數(shù)估算：配制相同濃度的偶聯(lián)物和純蛋白溶液，分別在同一波長下讀取OD值，然后按下列步驟計(jì)算： 半抗原OD值= 偶聯(lián)物OD值－純蛋白OD值 半抗原克分子濃度= 半抗原OD值/ 克分子消光系數(shù) 蛋白質(zhì)濃度= 偶聯(lián)物濃度－半抗原濃度 蛋白質(zhì)克分子濃度= 蛋白質(zhì)濃度/ 蛋白質(zhì)的分子量 [半抗原分子/ 蛋白質(zhì)分子]比值= 半抗原克分子濃度/蛋白質(zhì)克分子濃度 應(yīng)用本法計(jì)算時(shí)應(yīng)注意兩點(diǎn)： 1、讀取OD值可選用任何波長，但偶聯(lián)物與純蛋白的OD值應(yīng)有盡可能大的差異。即純蛋白的讀數(shù)要盡可能的低，以減少誤差。同時(shí)該波長處，半抗原的克分子消光系數(shù)應(yīng)為已知，否則須先用半抗原的純品通過實(shí)驗(yàn)求出。 2、由于聯(lián)接上了若干分子半抗原，所以偶聯(lián)物的分子量實(shí)際大于純蛋白質(zhì)的分子量，故計(jì)算的*步有一定的誤差。但蛋白質(zhì)的分子量遠(yuǎn)大于半抗原，所以如果波長選擇適當(dāng)，使蛋白質(zhì)的OD值盡量的小，則這種誤差不會(huì)很大。半抗原與載體結(jié)合的數(shù)目與免疫原性密切相關(guān)。一般認(rèn)為至少要有20個(gè)以上的半抗原分子連接到一個(gè)載體分子上，才能有效地刺激免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體。因此，在半抗原與載體連接后，應(yīng)測定偶聯(lián)到載體上的半抗原量。常用吸收光譜分析法測定，如果半抗原基團(tuán)有適宜的吸收光譜，測定在一定波長下復(fù)合抗原和載體之間克分子吸廣度的差別，然后把這個(gè)差別與同樣波長下半抗原的克分子吸光度數(shù)相比較，就可以準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)所結(jié)合的半抗原分子數(shù)。亦可應(yīng)用同位素標(biāo)記半抗原滲入法，在偶連反應(yīng)液中加入一定量的放射性標(biāo)記的半抗原。偶連反應(yīng)后經(jīng)充分透析，測量透析袋中的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算結(jié)合到載體上的半抗原分子數(shù)。 |
