本試劑盒僅供研究使用 檢測范圍：0.25 μg/ml-50 μg/ml
zui低檢測限：0.1 μg/ml
特異性：本試劑盒可檢測小鼠PAPP-A，且與其他相關(guān)物質(zhì)無交叉反應。
有效期：6個月
預期應用：ELISA法定量測定小鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中PAPP-A含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
實驗原理
本試劑盒應用競爭抑制酶標免疫分析法測定標本中待測物質(zhì)水平。用純化的二抗包被微孔板，制成固相抗體，往包被抗體的微孔中同時加入酶標的抗原，待測抗原以及抗體。經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。待測標本濃度越高，標記抗原和抗體的結(jié)合就越受到抑制，顯色愈淺。顯色的深淺與酶量呈正相關(guān)，而與樣品中待測物質(zhì)含量呈負相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 已包被抗PAPP-A抗體的酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 標準品（Standard）：5×0.5ml/瓶。 標準品 S1 S2 S3 S4 S5
濃度
（μg/ml） 0.25 1 5 20 50 3. 辣根過氧化物酶標記PAPP-A結(jié)合物（HRP-Conjugate）：1×0.6ml/瓶。
4. 抗PAPP-A抗體（Antibody）: 1×0.6ml/瓶。
5. 底物溶液A（Substrate A）：1×7ml/瓶。
6. 底物溶液B（Substrate B）：1×7ml/瓶。
7. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×15ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20倍。
8. 終止液（Stop Solution）：1×7ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規(guī)格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?0ul，余孔分別加標準品或待測樣品50ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部。
2. 然后在標準孔、待測樣品孔中加入50 ul稀釋好的酶標物工作液，以及50 ul抗體。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻（或直接輕輕晃動酶標板混勻）。酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應60分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
3. 溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200ul/每孔，甩干。
4. 依序每孔加底物溶液A和B各50ul，37℃避光顯色（15分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的后3-4孔有明顯的梯度藍色，前3-4孔顯色不明顯，即可終止）。
5. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
6. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
5. 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。 |
