本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷! 預期應用 ELISA法定量測定小鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中胃泌素含量。 實驗原理 用純化的胃泌素抗體包被微孔板,制成固相載體,往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的胃泌素抗體、HRP標記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物(TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胃泌素呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1、 酶標板:一塊(96孔) 2、 標準品(凍干品): 2瓶,請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為500 pg/ml,然后做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋),分別配制成500 pg/ml,250 pg/ml,125 pg/ml,62.5 pg/ml,31.2 pg/ml,15.6 pg/ml,7.8 pg/ml,樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pg/ml。如配制250 pg/ml標準品:取0.5ml (不要少于0.5ml )500 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。 3、 樣品稀釋液:1×20ml。 4、 檢測稀釋液A:1×10ml。 5、 檢測稀釋液B:1×10ml。 6、 檢測溶液A:1×120 /瓶(1:100)。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋(如:10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A),充分混勻,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100 /孔),實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。 7、 檢測溶液B:1×120 /瓶(1:100)。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。 8、 底物溶液:1×10ml/瓶。 9、 濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10、終止液:1×10ml/瓶(2 mol/L H2SO4)。 11、覆膜:5張 12、使用說明書:1份 自備物品 1、 酶標儀(建議儀器使用前提前預熱) 2、 微量加液器及吸頭,EP管 3、 蒸餾水或去離子水,濾紙 標本的采集及保存 1、 血清:全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,但應避免反復凍融。 2、 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存,但應避免反復凍融。 3、 其它生物標本:請1000 g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保 存,但應避免反復凍融。 注:以上標本均應密封保存,4 保存應小于1周,-20 不應超過1個月,-80 不應超過2個月;標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。 操作步驟 實驗開始前,各試劑均應平衡至室溫,試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時,均需充分混勻,混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量,如樣品濃度過高時,應對樣品進行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù)。 1、 加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?100 ,余孔分別加標準品或待測樣品100 ,注意不要有氣泡,加樣 時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37 溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效 性,每次實驗請使用新的標準品溶液。 2、 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 (臨用前配制),酶標板加上覆膜,37 溫育1小時。 3、 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板 3次,每次浸泡1-2分鐘,大約400 /每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。 4、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100 ,加上覆膜,37 溫育1小時。 5、 棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,方法同步驟3。 6、 每孔加底物溶液90 ,酶標板加上覆膜37 避光顯色(反應時間控制在15-30分鐘,當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔梯度不明顯時,即可終止)。 7、 每孔加終止溶液50 ,終止反應,此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應盡量與底物 液的加入順序相同。 8、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。 注: 1、 試劑準備:所有試劑在使用前應平衡至室溫,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。 2、 加樣:加樣或加試劑時,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的 “預溫育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)控制在10分鐘內(nèi)。推薦設置復孔進行實驗。 3、 溫育:為防止樣品蒸發(fā),實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi),以避免液體蒸發(fā);洗板后應盡快進行下步操作,任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。 4、 洗滌:洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應孔中吸水,同時要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。 5、 試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用,并使用相應的稀釋液配制,不能混淆。請 配制標準品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10 ),以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差;請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。 6、 反應時間的控制:加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘),如顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應,避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。 7、 底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射。 洗板方法 1、 手工洗板方法:將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體,在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次。 2、 自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。 特異性 本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠胃泌素,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應。 計算 各標準品及樣本OD值扣除空白孔OD值后作圖(七點圖),如設置復孔,則 應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標(對數(shù)坐標),OD值為橫坐標(對數(shù)坐標),在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,如 curve expert 1.3,根據(jù)樣品OD值,由標準曲線查出相應的濃度,乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。 檢測范圍: 7.8 pg/ml - 500 pg/ml,繪制標準曲線請取用以下濃度值:500 pg/ml,250 pg/ml,125 pg/ml,62.5 pg/ml,31.2 pg/ml,15.6 pg/ml,7.8 pg/ml。 zui低檢測限:3.9 pg/ml 說明 1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。 2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品,酶結(jié)合物或底物時,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的 “預孵育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且,洗滌不充分將影響試驗結(jié)果。 3. 試劑盒保存:部分試劑保存于-20℃,部分試劑保存于2-8℃,具體以標簽上的標示為準。 4. 濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。 5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。 6. 中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準。 7. 所有的樣品都應管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。 8. 有效期:6個月 |