本試劑盒僅供研究使用特異性：本試劑盒可檢測牛甘膽酸，且與其他相關物質無交叉反應。有效期：6個月預期應用：ELISA法定量測定牛血清、血漿或其它相關生物液體中甘膽酸含量。說明 1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。4．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。實驗原理本試劑盒采用酶聯免疫間接競爭法檢測甘膽酸。微孔板上包被有甘膽酸偶聯物。加入甘膽酸抗體和甘膽酸標準品或樣品，游離甘膽酸與微量反應板上的甘膽酸結合物競爭結合抗甘膽酸抗體，沒有結合的抗體被洗去，再向微孔中加辣根過氧化物酶標記二抗，與結合在反應板上的抗體作用一定時間，洗去多余的辣根過氧化物酶標記二抗。再向反應孔中加入相應反應底物TMB，作用一定時間后，結合的酶結合物將TMB轉化為藍色，轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的甘膽酸呈負相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 已包被甘膽酸偶聯物的酶聯板（Assay plate ）：一塊（96孔）。 2. 標準品（Standard）：2×250ul/瓶。3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：2×20ml/瓶。4. 甘膽酸單克隆抗體：1×60μl/瓶（1：100）5. 辣根過氧化物酶標記二抗（HRP-anti-antibody ）：1×120μl/瓶（1：100）6. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 7. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 8. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的試劑和器材1. 標準規(guī)格酶標儀2. 高速離心機3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 超聲清洗器5. 離子交換小柱（PCX）6. 氮氣吹干儀7. 干凈的試管和Eppendof管8. 系列可調節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器9. 蒸餾水，容量瓶等標本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶濃度為1000 ng/ml，以樣品稀釋液做系列倍比稀釋，分別稀釋1000 ng/ml，500 ng/ml，250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml。樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml。甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標記二抗的稀釋原則：臨用前以樣品稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（甘膽酸抗體每孔50ul，辣根過氧化物酶標記二抗每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標記二抗加990ul樣品稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。操作步驟實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 酶聯板使用前用洗液洗板2-3次，每次浸泡1-2分鐘，250ul/每孔，甩干。2. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品50ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul 膽酸抗體工作液。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應30分鐘（為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液）。3. 溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，250ul/每孔，甩干。4. 所有孔中加入100 ul辣根過氧化物酶標記二抗工作液。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應30分鐘5. 溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，250ul/每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內，一般10-15分鐘內，此時肉眼可見標準品的后3-4孔有明顯的梯度藍色，前3-4孔顏色不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。8. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。注：1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。 3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標記二抗工作液請依據所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標記二抗工作液。5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。 注意事項1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。3. 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。7. 底物請避光保存。8. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
