重組蛋白在宿主系統(tǒng)中高水平表達時，無論是原核表達體系或真核表達體系甚至高等真核表達體系，都會形成包涵體[2]。主要因為在重組蛋白的表達過程中，缺乏某些蛋白質折疊過程中需要的酶和輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的[3]。 1、 表達量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。 2、 重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。 3、 所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。 4、 是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。 5、 有報道認為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質的表達，當培養(yǎng)條件不佳時，容易形成包涵體。 減少包涵體形成的策略 1、 降低重組菌的生長溫度，降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的zui常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成[4]。 2、 添加可促進質可溶性表達的生長添加劑，培養(yǎng)E.coli時添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質的蛋白質聚集反應，在zui適濃度范圍內添加這些添加劑不會影響細胞的生長、蛋白質的合成或運輸，其它促質可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl[5]。 3、 供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造*培養(yǎng)條件，如供氧、pH等。 包涵體的分離及溶解 對于生物制藥工業(yè)來說，包涵體的形成也是有利的，不僅可獲得高表達、高純度的質，還可避免細胞水解酶對質的破壞。由于包涵體是蛋白質聚集而成的致密顆粒，分離的*步是對培養(yǎng)收集的細胞進行破碎，比較有效的方法是高壓勻漿結合溶菌酶處理，然后5000~20000g離心，可使大部分包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離，接著，包涵體沉淀需用去污劑（Triton X-100或脫氧膽酸鈉）和低濃度變性劑（2mol/L尿素或鹽酸胍等）洗滌除去脂類和膜蛋白，這一步很重要，否則會導致包涵體溶解和復性的過程中質的降解. 包涵體的溶解必須用很強的變性劑，如8mol/L尿素、6~8mol/L鹽酸胍，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，異氰鹽酸胍zui強；去污劑，如SDS[7]，可以破壞蛋白內的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法*去除而不允許用在制藥行業(yè)中；酸，如70%甲酸，可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時應加入還原劑（如DTT、GSH、β-ME）打開蛋白質中所有二硫鍵，對于目標蛋白沒有二硫鍵的有時也應使用還原劑，為含二硫鍵的雜蛋白會影響包涵體的溶解，同時還應加入金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子與還原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反應。 |
