一、原理 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氯霉素和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較可得出相應(yīng)殘留物氯霉素的含量。 二、試劑盒技術(shù)指標 試劑盒靈敏度： 0.05ppb 樣本定量檢測下限： 腸 衣————————————————0.1ppb 蜂 蜜———————————————— 0.1ppb 牛 奶————————————————0.05ppb 尿液、血清——————————————0.1ppb 組織、肝臟————————————— 0.025ppb 飼 料———————————————0.15ppb 樣本回收率： 組織、肝臟—————————————80%±10% 蜂蜜、腸衣—————————————70%±10% 牛奶、飼料—————————————85%±15% 尿液、血清———————————————70%±10% 交叉反應(yīng)率 氯霉素———————————————————100% 甲砜霉素————————————————— < 0.1% 氟甲砜霉素————————————————< 0.1% 三、 試劑盒組成 1、 微量測試孔：每條8孔，一板12條 2、 標準液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb 3、 酶標記物 12ml………………紅色帽 4、 抗體濃縮液 1ml…………………藍色帽 5、 底物 A 液 7ml……………… 白色帽 6、 底物 B 液 7 ml……………… 黑色帽 7、 終止液 7 ml……………… 黃色帽 8、 20X濃縮洗滌液 40ml………………白色帽 9、 2X濃縮復(fù)溶液 50ml………………透明帽 四、所用儀器、試劑 具備的儀器：微孔板酶標儀、氮氣吹干裝置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g ） 微量移液器：單道 20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl 試 劑：乙酸乙酯、乙腈、正己烷、去離子水、亞硝基鐵、硫酸鋅、葡萄糖苷酸酶（Merck,Art.No.4114）、醋酸鈉、醋酸 五、樣本前處理步驟 樣本處理前須知 處理任何樣本時，都必須注意： （a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、 禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。 （b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。 （c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染，干擾實驗結(jié)果。 樣本前處理需配制： 配液1、C液（牛奶樣本使用）： 0.36M 亞硝基（Na2Fe（CN）5·NO·2H2O）10.7g亞硝基鐵加去離子水100ml溶解。 配液2、D液（牛奶樣本使用）： 1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解。 配液3、 pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液（尿樣本使用）：稱2.4g醋酸鈉和1.2ml醋酸加去離子水500ml溶解混合。 配液4、乙腈-水溶液 V乙腈：VH2O＝84：16 配液5、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。（1份濃縮復(fù)溶掖+1份去離子水，用于抗體的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶）。 （a）組織、肝臟樣本前處理方法 1、 用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本； 2、 稱3±0.05g樣本于離心管中，先加入3ml去離子水充分混勻再加入6ml乙酸乙酯，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min； 3、 取出4ml上層液體在氮氣流50-60℃水浴中干燥； 4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml稀釋后的復(fù)溶液強烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。 5、 取50 µl下層相用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：0.5 （b）血清血漿 1、 取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩1min； 2、 靜置使水相與有機相分層或室溫4000r/min離心5min； 3、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮氣流50℃水浴中干燥； 4、 殘留物用1 ml稀釋后的復(fù)溶液溶解，混合30s； 5、 取50µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：1 （c）尿液 1、 移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml混合； 2、 加40µl葡萄糖苷酸酶（Merck,Art.No.4114）到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時（或過夜）； 3、 該溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合1min； 4、 室溫4000r/min離心10min，取出4ml上層液體在氮氣下50～60℃干燥； 5、 用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s； 6、 取50µl 用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：1 （d）蜂蜜 1、 取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中，用4ml 去離子水溶解； 2、 加入4ml乙酸乙酯上下振蕩5min； 3、 室溫4000r/min以上離心10min； 4、 移取2ml上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮氣流下干燥； 5、 用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解，混合30s； 6、 取50 µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：0.5 檢測下限：0.025ppb 定量下限：0.1 ppb 注：我們推薦0.1 ppb為陽性樣本的cut off值。 （e）腸衣 1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本注：干樣本需剪碎（長度不超5mm）后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂洗20min以上（去除表面的鹽份），瀝干后再進行均質(zhì)。 2、 稱1±0.05g均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入10ml乙酸乙酯，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min。 3、 取出5ml上層液體（相當于0.5g的樣本）在氮氣流下50-60℃干燥。 4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml稀釋后的復(fù)溶液強烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上，離心5min。 5、 去上層相，取下層50 µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：1 （f）牛奶和奶粉 牛奶樣本處理方法一 1、 牛奶樣本，10℃4000r/min以上離心10min，吸除上層脂肪； 2、 取5ml去除脂肪奶樣至離心管中，加入150µlC液出現(xiàn)沉淀，短暫振蕩后加入150µlD液混合； 3、 15℃4000r/min以上，離心10min，移取上層液； 4、 用稀釋后的復(fù)溶液以等體積稀釋上層液，混合30s； 5、 取50µl用于分析。 注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。 樣本稀釋倍數(shù)：2 檢測下限：0.1ppb 定量下限：0.15ppb 牛奶樣本處理方法二 1、 取5ml去除脂肪奶樣至離心管中； 2、 加入250µlC液和250µlD液*混合，4-12℃4000r/min以上離心10min。如果沒有冷凍離心機，請預(yù)先將樣本冷卻到8℃； 3、 轉(zhuǎn)移出2.2ml上層液（相當于2ml奶樣）至一 個新的離心管中，加入4ml乙酸乙酯上下振蕩5min； 4、 室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min ； 5、 轉(zhuǎn)移出2ml乙酸乙酯上層液體（相當于1ml奶樣），60℃氮氣流下*干燥； 6、 用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s； 7、 取50µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：0.5 檢測下限：0.025ppb 定量檢測限：0.05ppb 由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾 （在某些 情況下干擾數(shù)值在標準2到3之間），所以推薦標準3作為陽性結(jié)果的CUT OFF判斷值。 奶粉樣本處理方法 1、 稱2±0.05 g奶粉至離心管中，加入10ml去離子水，振蕩溶解； 2、 加1ml C液和1ml D液*混合。4-12℃4000r/min以上離心10min。若無冷凍離心機，請預(yù)先將樣本冷卻到8℃； 3、 轉(zhuǎn)移出3.6ml上層液（相當于0.6g奶粉）至一 個新的離心管中，加入6ml乙酸乙酯上下來回 振蕩5min； 4、 室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min； 5、 轉(zhuǎn)移出4ml乙酸乙酯上層液體（相當于0.4g奶粉），60℃氮氣流下*干燥； 6、 用0.4ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s； 7、 取50µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測下限：0.05ppb 定量檢測限：0.15ppb 由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標準2到3之間），所以推薦標準3作為陽性結(jié)果的CUT OFF判斷值。 （g）蛋類 1、 用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣本（蛋黃或全蛋）； 2、 稱取3±0.05 g均質(zhì)過的樣本，與9ml乙腈-水溶液（84︰16；V乙腈︰V水）振蕩5min，15℃ 4000r/min以上離心10min； 3、 取3ml上層與3ml蒸餾水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯混合5min，15℃4000r/min以上離心10min； 4、 將上層有機相轉(zhuǎn)移到試管中50℃下氮氣吹干； 5、 加入1ml正己烷溶解殘留物后，用2ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除正己烷。 6、 取50µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：2 檢測下限：0.1ppb 定量檢測限：0.3ppb （h）飼料 1、 稱取2±0.05g均質(zhì)過的飼料樣本，加入2ml去離子水，再加入6ml乙酸乙酯，充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min； 2、 取2ml上層有機相到試管中56℃下氮氣吹干； 3、 加入1ml正己烷溶解殘留物，用1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷。 4、 取50µl用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：3 檢測下限：0.15ppb 六、 酶標免疫分析程序 測定前應(yīng)須知： 1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。 2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。 3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。 4、 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。 操作步驟 1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 2、 取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。 3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。 4、 編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。 5、 將濃縮抗體用已稀釋好的復(fù)溶液11倍稀釋（1份抗體加入10份稀釋液，按需配制使用） 6、 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。 7、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。 8、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。 9、 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。 10、測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。 七、結(jié)果判定 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含氯霉素成反比。 1、 粗略判定： 用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍（ppb）。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.250，樣本2的吸光度值為0.720，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.610；0.05ppb為1.380；0.15ppb為1.100；0.45ppb為0.620；1.35ppb為0.289；4.05ppb為0.108。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb-4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15 ppb-0.45 ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。 2、 定量分析 （1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即 B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值 （2）標準曲線的繪制與計算 以標準品百分吸光率為縱坐標，以氯霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?/span> 八、注意事項 1、 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫 （20-25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。 2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。 3、 試劑混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。 4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。 5、 不要使用過了有效期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。 6、 將不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。 7、 試劑變質(zhì)的跡象 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。 8、 該試劑盒*反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。 九、儲藏條件和保質(zhì)期 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。 提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。 |
